PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)

一、PCR的認(rèn)識(shí)
臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)又稱(chēng)  PCR實(shí)驗(yàn)，PCR 是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡(jiǎn)稱(chēng)，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的 DNA 片段，可看作生物體外的特殊 DNA 復(fù)制。PCR實(shí)驗(yàn)室是專(zhuān)門(mén)用來(lái)檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測(cè)手段。它可以通過(guò)將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測(cè)出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測(cè)方法可以測(cè)出普通檢驗(yàn)難以檢測(cè)出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對(duì)樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測(cè)部門(mén)的禽疫病診斷。

                                                                           
二、依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范
設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿(mǎn)足《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB19489-2008[4]、《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]8 號(hào)文[5]、《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10 號(hào)文[6]、《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10 號(hào)文附件。
三、PCR實(shí)驗(yàn)室布局
PCR實(shí)驗(yàn)室根據(jù)其工藝流程主要分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、核酸提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū) 4 個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域，其中試劑準(zhǔn)備區(qū)、核酸提取區(qū)為擴(kuò)增前區(qū)，擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)為擴(kuò)增后區(qū)。

                                                                            
四、實(shí)驗(yàn)室氣壓控制
PCR 實(shí)驗(yàn)室并沒(méi)有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。
（1）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
（2）標(biāo)本制備區(qū)主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定 RNA 時(shí) cDNA 的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。
（3）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)主要進(jìn)行的操作為 DNA 或  cDNA 擴(kuò)增。此外，已制備的 DNA 模板和合成的 cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))  的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))  制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式  PCR 測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開(kāi)反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。
（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。

五、PCR實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備
（1）試劑準(zhǔn)備室
試劑準(zhǔn)備室主要承擔(dān) PCR 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑的配制、分裝和保存。主要設(shè)備包括實(shí)驗(yàn)臺(tái)、試劑柜、冰箱、天平、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、紫外燈等。
（2）核酸提取室
核酸提取室主要承擔(dān)樣品核酸的提取，樣品的混樣和測(cè)試樣品的制備。主要設(shè)備包括實(shí)驗(yàn)臺(tái)、冰箱、生物安全柜（或通風(fēng)柜、潔凈工作臺(tái)）、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、恒溫水浴鍋、紫外燈等。其中生物安全柜、通風(fēng)柜和潔凈工作臺(tái)的選擇與測(cè)試樣品的特性有關(guān)，生物安全柜主要用于疾控中心、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室等；通風(fēng)柜主要用于植物 DNA 檢測(cè)和檢疫等；潔凈工作臺(tái)主要用于對(duì)潔凈條件要求較高的 PCR 實(shí)驗(yàn)。
（3）擴(kuò)增室
擴(kuò)增室主要承擔(dān)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的配制和模板加入。主要設(shè)備包括實(shí)驗(yàn)臺(tái)、熒光定量 PCR 儀、熒光計(jì)、冰箱、生物安全柜（或通風(fēng)柜、潔凈工作臺(tái)）、離心機(jī)、加樣器、紫外燈等。
（4）產(chǎn)物分析室
產(chǎn)物分析室主要承擔(dān)核酸產(chǎn)物的測(cè)定。主要設(shè)備包括實(shí)驗(yàn)臺(tái)、測(cè)序儀、冰箱、離心機(jī)、加樣器、紫外燈等。

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